Diana chào đời trong buổi chiều muộn ngày 1/7/1961 tại Sandringha, Norfolk (Anh), cha là John Spencer, mẹ Frances Shand Kydd. Bố mẹ Diana lúc đó hi vọng thành viên mới trong gia đình là một bé trai, người sẽ thừa kế sản nghiệp của gia đình. Họ đã chuẩn bị sẵn tên cho một cậu ấm nên khi nhóc tì chào đời là bé gái, một tuần sau, bé mới có tên: Diana Frances.
Ba năm sau, niềm mong mỏi của gia đình Spencer – dòng họ danh tiếng lâu đời bậc nhất nước Anh - đã trở thành sự thật, em trai của Diana, Charles Charles chào đời. Diana còn có 2 chị là Lady Sarah, Jane Baroness Fellowes.
Chị em Diana sống êm ấm, đầy đủ trong Park House, ngôi nhà của Hoàng gia Anh mà cha Diana thuê. Nhà rộng, có khu vui chơi cho trẻ em lại là hàng xóm của Hoàng gia Anh. Hồi đó, Hoàng tử Andrew và Hoàng tử Edward (các con của Nữ hoàng Elizabeth II) vẫn thường tới Park House chơi cùng chị em nhà Diana. Bọn trẻ bơi và chơi trò dự tiệc tại Park House mà không cần nghi lễ hoàng tộc. Cha của Diana vốn là quan hầu trong Hoàng gia Anh nên có mối quan hệ khá thân thiết.
Tuy nhiên, không khí gia đình Diana dần trở nên căng thẳng. Cha Diana thích sống ở vùng thiên nhiên rộng lớn, thích câu cá săn bắn còn mẹ Diana lại muốn ở vùng thành phố. Họ cãi nhau ngày càng nhiều hơn. Diana thường xuyên chứng kiến cảnh đó khi mới 4 tuổi. Lên 7 tuổi, gia đình tan vỡ, bố mẹ Diana ly hôn. Anh chị em của công nương tương lai ở với bố.
Khi đó, em út trong gia đình, cậu bé Charles, mới 4 tuổi. Charles nhớ mẹ. Tuy nhỏ tuổi nhưng Diana cố lấp chỗ trống trong lòng em trai. Cô bé chăm sóc, vỗ về em thay mẹ.
Lớn hơn một chút, Diana học trường nội trú. Diana chọn Riddlesworth ở Norfolk, trường chỉ dành riêng cho học sinh nữ. Nhút nhát, dễ tổn thương, cô bé khó hòa nhập với môi trường. Các môn như toán, lịch sử, địa lý, tiếng Pháp giống như con ác mộng với Diana ngày ấy. Cô chỉ thích ở nhà đọc truyện của tác giả Barbara Cartland. Tuy nhiên, trong thời gian này, những thế mạnh trong cô bé cũng bộc lộ. Diana yêu thích và đạt thành tích cao trong các môn thể thao như bơi lội, tennis, khiêu vũ, múa ba lê. Thời gian sau đó, Diana đạt nhiều giải thưởng trong các cuộc thi bơi lội.
Cha Diana cho cô học trường West Heath Boarding School ở Kent. Tại đây, cô dâu Hoàng gia tương lai thể hiện năng khiếu âm nhạc rất tốt. Bên cạnh đó, cô còn nhận giải thưởng của trường West Health vì tinh thần cộng đồng. Năm 1976, cha cô tái hôn. Ngôi nhà thân yêu ngày nào giờ không còn là chốn đi về của chị em cô vì sự hiện diện của mẹ kế.
Năm 1977, cô rời West Health và học trường Institut Alpin Videmanette ở Thụy Sĩ. Vào khoảng thời gian đó, cô gặp Thái tử Charles, người thừa kế ngai vàng của nước Anh. Cặp đôi sau đó yêu nhau và kết hôn năm 1981. Họ có 2 con là Hoàng tử William và Hoàng tử Harry.